Tester och metodik vid Åstrandlaboratoriet

Vid Åstrandlaboratoriet finns ett arbetsfysiologisk och ett biokemiskt laboratorium.

I det arbetsfysiologiska laboratoriet finns utrustning för att göra arbetstester, mäta kondition och prestation hos frivilliga försökspersoner.

I biokemilaboratoriet genomförs histokemiska, biokemiska och molekylärbiologiska analyser på blod och muskelprover. Nedan följer en kort beskrivning av olika metoder samt dess användningsområde inom arbetsfysiologin.

Mätning av maximal syreupptagning

Detta test mäter din kondition eller mer korrekt hur mycket syre din kropp kan ta upp under maximalt arbete. Testet tar ca 8-12 min och görs normalt på löpband eller ergometercykel. Vid löpning ökar belastningen successivt från joggning till hård löpning tills du inte orkar mer. Under testet bär du en mask för att vi skall kunna mäta syrehalten i din utandningsluft och den volym luft du andas in och ut per min (ventilationen).

Lite förenklat så beräknas din maximala syreupptagning (i liter per min) genom att multiplicera ventilationen med skillnaden i syreinnehåll i rumsluft och utandningsluft. Ofta divideras sedan detta värde sedan med kroppsvikten och man får det s.k. testvärdet, dvs. maximal syreupptagning i ml per min och kg.

En motionär ligger vanligen mellan 40-50 ml/min/kg medan vältränade elitidrottare i konditionsidrotter har testvärden på > 70 ml/min/kg. Under ett maxtest registreras även hjärtfrekvensen kontinuerligt.

Beräkning av maximal syreupptagning

Om man inte har tillgång till den utrustning som krävs för att mäta maximal syreupptagning eller av andra anledningar inte har möjlighet att genomföra ett maximalt test så finns det icke-maximala tester som kan användas för att beräkna den maximala syreupptagningsförmågan. Vanligtvis görs dessa på en ergometercykel.

Åstrandtestet är det mest kända testet för bestämning av kondition. Det togs fram på 1960-talet av makarna P-O och Irma Åstrand vid GIH. Läs mer om Åstrandtestet i "Åstrands testhandbok" .

Nyligen presenterades en vidareutveckling av testet, det så kallade Ekblom-Bak testet. Mer om det testet kan du läsa här www.gih.se/ekblombaktest.

Det dagliga aktivitetsmönstret

Sedan 1950-talet har otaliga studier visat på betydelsen av fysisk aktivitet för hälsa i vid bemärkelse. Såväl nationellt som internationellt rekommenderas idag fysisk aktivitet minst 150 minuter i veckan på en medelhög intensitetsnivå, vilket innebär att man börjar bli varm och lite andfådd, för att främja hälsa och förebygga sjukdom.

Det är emellertid viktigt att tänka på att vårt samhälle och våra levnadsvanor är i ständig förändring. För drygt 10 år sedan kom de första studierna som visade att längre stunder av dagligt stillasittande innebar en ökad risk för flertalet av de vanliga folksjukdomarna. Dessutom kunde man visa at betydelsen av den lågintensiva, vardagliga aktiviteten blev av allt mer betydelse då många inte motionerade regelbundet.

Behovet av att på ett tillförlitligt sätt kunna mäta hela det dagliga rörelsemönstret (alltifrån stillasittande och lågintensiv aktivitet till medel/högintensiv motion) är således påtagligt. Att själv be en person återrapporter hur mycket man sitter eller rör på sig är en enkel metod, men inte särskilt tillförlitlig.

På GIH arbetar vi sedan ett antal år tillbaka med att mäta det dagliga aktivitetsmönstret med objektiva metoder. Det är små mätare (så kallade accelerometrar och inclinometrar) som bärs på höften i ett bälte, runt handleden eller fastsatt på låret.

När en person rör sig så uppstår en acceleration, och det är den som accelerometern registrerar. Ju mer intensivt man rör sig, ju större utslag. Stillasittande eller stillastående ger inget utslag. Inclinometern, som fästs på låret, kan avgöra om personen står eller sitter.

På detta sätt kan vi i olika studier och situationer avgöra hur mycket en person sitter eller rör på sig samt hur aktiviteten/stillasittandet är fördelat över dagen eller veckan. Vi kan sedan beskriva detta eller relatera det till olika utfall, såsom välmående, sjukdomsrisk eller prestationsförmåga.

Vävnadsprov

I de flesta studier som genomförs vid Åstrandlaboratoriet tas blodprov och muskelprov i samband med arbetsförsök. Muskelprovtagning (biopsi) är ett mindre kirurgiskt ingrepp. Hud och muskelyta bedövas och ett litet snitt görs varefter en nål eller tång förs in i muskeln och en liten bit av muskel skärs ut. Den lilla mängd muskelvävnad som avlägsnas påverkar inte muskelfunktionen och muskelfibrerna repareras efter kort tid.

Muskelbiopsin består av 200-500 fragment av muskelfibrer och väger mellan 20 och 80 mg. Vanligtvis tas muskelbiopsier från m. vastus lateralis, den yttre delen av främre lårmuskeln. I vissa fall görs analyser på färsk muskel, men det vanligaste är att muskelbiopsin fryses så snabbt som möjligt i flytande kväve och förvaras vid -80 grader i väntan på analys.

Mätning av syreupptagning in vitro

I flera studier som för närvarande pågår vid Åstrandlaboratoriet undersöks hur olika typer av träning påverkar muskelns maximala syreförbrukning. Det sker genom att intakta buntar av fibrer från en muskelbiopsi inkuberas under standardiserade förhållanden och syreförbrukning mäts efter tillsats av olika substrat. Mätningar genomförs även på isolerade mitokondrier. Utrustningen som används heter Oxoboros och ger unika möjligheter att undersöka hur träning och nutrition påverkar syreupptagningen in vitro.

Histokemiska analyser

Den humana muskulaturen består av en blandning av långsamma (typ I) och snabba (typ II) muskelfibrer med olika kontraktila och metabola egenskaper. Med hjälp av histokemisk metodik kan vi få information om fibersammansättning, fiberytor, kapillärtäthet och glykogeninnehåll i enskilda fibrer.

För denna typ av analyser monteras muskelbiopsin i ett "vävnadsklister" (Tissue Tek), fryses i isopentan som kylts av flytande kväve för att undvika frysskador. I en kryostat (vid -20 °C) skärs tunna tvärsnitt (10 µm) av muskelfibrer som sätts fast på ett täckglas och därefter behandlas på olika sätt beroende på efterföljande analys.

Vid analys av fiberkomposition, dvs. andel snabba och långsamma fibrer, använder man sig av kunskapen att enzymet myosin ATPas har olika pH känslighet i olika fibertyper. Enzymet inaktiveras i långsamma fibrer vid alkaliskt pH vilket gör att dessa fibrer framträder som vita medan snabba fibrer med intakt ATPas aktivitet blir svarta i den slutgiltiga färgningsproceduren.

Analyser på enskilda muskelfibrer

Den histokemiska metodiken ger endast ett semikvantitativt mått på substratinnehåll i olika fibertyper. För att kvantifiera exempelvis glykogen, aminosyrakoncentration, enzymaktivitet eller genuttryck i enskilda fibrer frystorkas muskelbiopsin och enstaka muskelfibrer (väger vanligtvis endast 1-5 µg) separeras från varandra.

En del av fibern skärs av och identifieras som typ I eller typ II med hjälp av ATPas färgning (se ovan). Den resterande delen av fibern används för biokemiska eller molekylärbiologiska analyser vilka görs på enstaka muskelfibrer eller på pooler av typidentifierade fibrer.

Biokemiska analyser

Glukos, laktat och hormonnivåer i plasma analyseras vanligtvis i samband med arbetsförsök. De förstnämnda med enzymatisk metodik i en spektrofotometer och hormonnivåer i en plattläsare med hjälp av färdiga kit.

Koncentrationen av muskelglykogen analyseras ofta i biopsier tagna i samband med träning för att beräkna förbrukningen under arbete. Glykogen bryts ner enzymatiskt i en buffertlösning och glukoshalten analyseras därefter med samma metodik som för glukos i plasma. Mätning av maximal aktivitet av enzymer som reglerar nedbrytningen av kolhydrater och fett kan även det göras på humana biopsier. Muskelprovet homogeniseras under optimala betingelser och efter tillsats av substrat följs reaktionshastigheten i en spektrofotometer.

Enzymer med så låg maximal aktivitet att den inte kan mätas med nämnda metodik analyseras i stället genom att enzymets substrat märks med en radioaktiv isotop och omvandlingen till produkt (efter separation från märkt substrat) mäts under en given tid i en scintillationsräknare.

Proteinkemiska metoder

I flertalet studier vid laboratoriet undersöks hur träning och nutrition påverkar enzymaktiviteten av specifika enzym som anses reglera olika processer i muskeln. När aktiviteten av ett enzym är låg eller man vill undersöka bakomliggande mekanismer, används en metodik som heter Western blot.

För denna analys, frystorkas och rensas muskelprovet från bindväv och blod. Därefter homogeniseras provet och proteinerna separeras med SDS-PAGE, en metod som separerar proteiner med avseende på molekylvikt.

Lite förenklat så vandrar proteinerna med olika hastighet genom en polyakrylamidgel efter att en elektriskt spänning lagts över gelen. Det protein med lägst molekylvikt vandrar snabbast genom gelen.

Nästa steg är att överföra proteinerna till ett membran (PVDF) som därefter inkuberas med en specifik antikropp (primär antikropp) mot proteinet av intresse.

Därefter appliceras en sekundär antikropp som binder till den primära antikroppen och mängden protein detekteras efter tillsats av ett reagens som sänder ut kemiluminiscent ljus.

Molekylärbiologiska metoder

Träning ökar genuttrycket av ett flertal proteiner som reglerar omsättningen av kolhydrater, fett och protein. Redan ett enstaka träningspass kan stimulera en viss gen, vilket kan ge en indikation på förändring efter mer långvarig träning. Stimulering av en viss gen mäts som förändring i uttryck av mRNA.

Det första steget i denna analys är att isolera RNA från muskelprovet, därefter syntetiseras cDNA som via en cyklisk värmebehandling gör att genen amplifieras till mätbara nivåer av mRNA. Denna metodik kallas RT-PCR.

Kromatografiska metoder

För analys av aminosyror i plasma och muskel används vätskekromatografi. Förenklat kan man säga att provet separeras i en kolonn med specifik sammansättning beroende på hur starkt de binds till kolonnmaterialet.

För att provet skall vandra genom kolonnen pumpas en så kallad mobilfas (vanligtvis ett lösningsmedel) genom kolonnen med en given hastighet. Olika aminosyror vandrar olika snabbt genom kolonnen och detekteras därefter utifrån sin molekylvikt med hjälp av en masspektrometer.

Den metodik som nyligen utvecklats vid laboratoriet kallas UPLC (ultra performance liquid chromatography).